Святитель Митрофан, первый епископ Воронежский, родился 6 ноября 1623 года во Владимирской земле, по предположению, в семье священника. Мирское имя будущего святителя было Михаил.
Половину своей жизни святой прожил в миру, был женат и имел детей. Сохранились сведения о заботливости святого Митрофана по воспитанию своего сына Ивана. Будущий епископ был некоторое время священником в селе Сидоровском Суздальской епархии. На 40-м году жизни он овдовел и решил посвятить свою жизнь Богу. Своим местожительством он избрал Золотниковский Успенский монастырь недалеко от Суздаля, где и был пострижен в иночество с именем Митрофан.
Здесь угодник Божий начал иноческое подвижничество, отличаясь глубоким смирением. О его строгой иноческой жизни стало известно в монашеской среде. Через три года после вступления в Золотниковскую обитель братия соседнего Яхромского Космина монастыря, не имевшего в ту пору настоятеля, стали просить местное духовное начальство о доставлении им в игумены Митрофана. Просьба была исполнена. Вначале подвижник был рукоположен в иерейский сан, затем, несмотря на нежелание, был возведен в игумены Яхромской обители.
Когда о ревности подвижника узнал Патриарх Московский и всея Руси Иоаким, он поручил ему более обширную Унженскую обитель, основанную в XV в. преподобным Макарием Желтоводским в Костромской земле. Здесь будущий святитель настоятельствовал около семи лет, в течение которых монастырь достиг процветания. Был построен храм в честь Благовещения Пресвятой Девы Марии, написано немало замечательных икон.
Монастырь игумена Митрофана привлекал внимание не одного Патриарха, но и царя Феодора Алексеевича, который посещал обитель и нередко беседовал с настоятелем. При дворе к святому относились с особым почтением. Когда в 1682 году, по решению Московского Церковного Собора 1681 года, была образована новая Воронежская епархия, царь Феодор первым ее епископом предложил назначить игумена Митрофана. Епископскую хиротонию 2 апреля 1682 года возглавил Патриарх Иоаким.
Святителю Митрофану пришлось быть свидетелем бунта раскольников в июле того же года и присутствовать на «прении о вере» между старообрядцами и православными в Грановитой палате. Это событие произвело на него сильное впечатление и впоследствии сказалось на его архиерейских делах. Святитель Митрофан приобрел известность как обличитель раскола и сподвижник патриотических начинаний царя-реформатора. Святитель Митрофан рассматривал духовенство как силу, способную воздействовать на население самым благотворным образом. В самом начале своей деятельности святитель начал сооружать в Воронеже новый каменный храм в честь Благовещения Пресвятой Богородицы. Святитель Митрофан любил церковное благолепие и вкладывал в строительство собора огромные средства. Быт святителя был более чем скромен.
Особую страницу в биографии святителя Митрофана составляют его взаимоотношения с Петром I. Святитель глубоко и сочувственно входил в судьбу молодого царя, старался содействовать возникавшим полезным для Отечества преобразованиям. Он одобрял постройку флота, предпринятую Петром I в Воронеже, и поддержал ее материально. Когда в 1696 году русские войска одержали победу над турками под Азовом, Петр I повелел святителю Митрофану как бы в награду за участие в этой победе именоваться епископом Воронежским и «Азовским». В то же время святитель Митрофан не мог одобрить слишком тесного общения царя с иноземными иноверцами и бездумного восприятия их обычаев. Святитель отказался посетить воронежский дворец царя из-за находившихся в нем языческих статуй. Когда разгневанный Петр стал грозить ему смертью, святитель начал готовиться к ней, предпочитая умереть, нежели одобрить неприемлемые для православного человека языческие ритуалы.
Исповедничество епископа устыдило Петра, в знак согласия с ним он убрал статуи, и мир был восстановлен. На Воронежской кафедре угодник Божий пробыл 20 лет, до самой своей кончины.
Любимым размышлением святого было памятование о смерти, о загробной жизни, о мытарствах; любимой молитвой — молитва об умерших.
Не будучи знаком с распространенной в XVII в. латинской схоластикой, святитель Митрофан прекрасно знал Священное Писание и святоотеческие труды. В своем «Духовном завещании» святитель Митрофан назидал: «Для всякого человека таково правило мудрых мужей: употреби труд, храни умеренность — богат будешь; воздержно пей, мало ешь — здрав будешь; твори благо, бегай злого — спасен будешь». Преставился к Богу святитель Митрофан в 1703 году в глубокой старости. Незадолго до кончины святитель принял схиму с именем Макарий. Погребен он был в Благовещенском соборе в Воронеже с большими почестями: царь своими руками помогал нести гроб святителя, почитаемого им за «святого старца».
С 1820 года число почитателей молитвенной памяти святителя Митрофана особенно возросло, при соборе начали появляться записи о чудесах на его гробнице. В 1831 году последовало официальное донесение об этом Синоду, по решению которого 7 августа 1832 года состоялось торжественное открытие гроба, а затем последовала канонизация святителя. От его святых мощей по милости Божией происходили многочисленные исцеления страждущих телесными и душевными недугами, одержимых, расслабленных. В 1836 году при Благовещенском соборе в Воронеже был учрежден Благовещенский Митрофанов монастырь.